无公害食品 水产品中渔药残留限量（NY 5070—2002）

 1  范围

本标准规定了无公害水产品中渔药及通过环境污染造成的药物残留的最高限量。

本标准适用于水产养殖品及初级加工水产品、冷冻水产品，其他水产加工品可以参照使用。

2  规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

NY 5029—2001  无公害食品  猪肉

NY 5071  无公害食品  渔用药物使用准则

SC/T 3303—1997  冻烤鳗

SN/T 0197—1993  出口肉中喹乙醇残留量检验方法

SN 0206—1993  出口活鳗鱼中噁喹酸残留量检验方法

SN 0208—1993  出口肉中十种磺胺残留量检验方法

SN 0530—1996  出口肉品中呋喃唑酮残留量的检验方法  液相色谱法

3  术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

渔用药物   fishery drugs

用以预防、控制和治疗水产动、植物的病、虫、害，促进养殖品种健康生长，增强机体抗病能力以及改善养殖水体质量的一切物质，简称“渔药”。

3.2

渔药残留  residues of fishery drugs

在水产品的任何食用部分中渔药的原型化合物或/和其代谢产物，并包括与药物本体有关杂质的残留。

3.3

最高残留限量  maximum residue Limit,MRL

允许存在于水产品表面或内部（主要指肉与皮或/和性腺）的该药（或标志残留物）的最高量/浓度（以鲜重计，表示为：mg/kg或mg/kg）。

4  要求

4.1  渔药使用

水产养殖中禁止使用国家、行业颁布的禁用药物，渔药使用时按NY 5071的要求进行。

4.2  水产品中渔药残留限量要求

水产品中渔药残留限量要求见表1。

表1  水产品中渔药残留限量

5  检测方法

5.1  金霉素、土霉素、四环霉

金霉素测定按NY 5029—2001中附录B规定执行，土霉素、四环素按SC/T 3303—1997中附录A规定执行。

5.2  氯霉素

氯霉素残留量的筛选测定方法按本标准中附录A执行，测定按NY 5029—2001中附录D（气相色谱法）的规定执行。

5.3  磺胺类

磺胺类中的磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶的测定按SC/T 3303的规定执行，其他磺胺类按SN/T 0208的规定执行。

5.4  噁喹酸

噁喹酸的测定按SN/T 0206的规定执行。

5.5  呋喃唑酮

呋喃唑酮的测定按SN/T 0530的规定执行。

5.6  己烯雌酚

己烯雌酚残留量的筛选测定方法按本标准中附录B规定执行。

5.7  喹乙醇

喹乙醇的测定按SN/T 0197的规定执行。

6  检验规则

6.1  检验项目

按相应产品标准的规定项目进行。

6.2  抽样

6.2.1  组批规则

同一水产养殖场内，在品种、养殖时间、养殖方式基本相同的养殖水产品为一批（同一养殖池，或多个养殖池）；水产加工品按批号抽样，在原料及生产条件基本相同下同一天或同一班组生产的产品为一批。

6.2.2  抽样方法

6.2.2.1  养殖水产品

随机从各养殖池抽取有代表性的样品，取样量见表2。

表2  取样量

6.2.2.2  水产加工品

每批抽取样本以箱为单位，100箱以内取3箱，以后每增加100箱（包括不足100箱）则抽1箱。

按所取样本从每箱内各抽取样品不少于3件，每批取样量不少于10件。

6.3  取样的样品的处理

采集的样品应分成两等份，其中一份作为留样。从样本中取有代表性的样品，装入适当容器，并保证每份样品都能满足分析的要求；样品的处理按规定的方法进行，通过细切、绞肉机绞碎、缩分，使其混合均匀；鱼、虾、贝、藻等各类样品量不少于200 g。各类样品的处理方法如下：

a）鱼类：先将鱼体表面杂质洗净，去掉鳞、内脏，取肉（包括脊背和腹部）肉和皮一起绞碎，特殊要求除外。

b）龟鳖类：去头、放出血液，取其肌肉包括裙边，绞碎后进行测定。

c）虾类：洗净后，去头、壳，取其肌肉进行测定。

d）贝类：鲜的、冷冻的牡蛎、蛤蜊等要把肉和体液调制均匀后进行分析测定。

e）蟹：取肉和性腺进行测定。

f）混匀的样品，如不及时分析，应置于清洁、密闭的玻璃容器，冰冻保存。

6.4  判定规则

按不同产品的要求所检的渔药残留各指标均应符合本标准的要求，各项指标中的极限值采用修约值比较法。超过限量标准规定时，允许加倍抽样将此项指标复验一次，按复验结果判定本批产品是否合格。经复检后所检指标仍不合格的产品则判为不合格品。

附  录  A

（规范性附录）

氯霉素残留的酶联免疫测定法

A.1  适用范围

本方法适用于测定水产品肌肉组织中氯霉素的残留量。

A.2  原理

利用抗体抗原反应。微孔板包被有针对兔免疫球蛋白（IgG）（氯霉素抗体）的羊抗体，加入氯霉素抗体、氯霉素标记物、标准和样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体，同时氯霉素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被洗去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并孵育；结合的酶标记物将无色的发色剂转化成蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝变为黄，在450 nm处测量，吸光度与样品的氯霉素浓度成反比。

A.3  检测限

筛选方法的检测下限为1mg/kg。

A.4  仪器

A.4.1  离心机。

A.4.2  微孔酶标仪（450 nm）。

A.4.3  旋转蒸发仪。

A.4.4  混合器。

A.4.5  移液器。

A.4.6  50mL，100mL，450mL微量加液器等。

A.5  药品和试剂

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

A.5.1  乙酸乙酯。

A.5.2  乙腈。

A.5.3  正己烷。

A.5.4  磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.2）：0.55 g磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O），2.85 g磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·2H₂O），9 g氯化钠（NaCl）加入蒸馏水至1 000 mL。

A.6  标准溶液

分别取标准浓缩液50 mL用450 mL缓冲液1（试剂盒提供）稀释并混均匀，制成0、50ng/L、50 ng/L、450 ng/L、1 350 ng/L、4 050 ng/L的标准溶液。

A.7  样品提取和纯化

A.7.1  取5.0 g粉碎的鱼肉样品（样品先去脂肪组织），与20 mL乙腈水溶液（86+16）混合10 min,15℃离心10 min（4 000r/min）。

A.7.2  取3 mL上清液与3 mL蒸馏水混合，加入4.5 mL乙酸乙酯混合10 min，15℃离心10 min（4 000r/min）。

A.7.3  将乙酸乙酯层转移至另一瓶中继续干燥，用1.5 mL缓冲液1溶液干燥的残留物，加入1.5 mL正己烷混合。

A.7.4  完全除去正己烷层（上层），取50mL水箱进行分析。

A.8  样品测定程序

A.8.1  将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，记录下标准和样品的位置，每一样品和标准做两个平行实验。

A.8.2  加入50mL稀释了的酶标记物到微孔底部，再加入50mL的标准或处理好的样品液到各自的微孔中。

A.8.3  加入50mL稀释了的抗体溶液到每一个微孔底部充分混合，在室温孵育2 h。

A.8.4  倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，然后用250mL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作两次。

A.8.5  加入50mL基质、50mL发色试剂到微孔中，充分混合并在室温、暗处孵育30 min。

A.8.6  加入100mL反应停止液到微孔中，混合好，以空气为空白，在450 nm处测量吸光度值（注意：必须在加入反应停止液后60 min内读取吸光度值）。

A.9  结果

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，得到以百分比给出的吸光度值，以式（A.1）表示：

                                                  ············································ （A.1）

式中：

E——吸光度值，%；

A——标准或样品的吸光度值；

A₀——0标准的吸光度值。

以计算的标准值绘成一个对应氯霉素浓度（ng/L）的半对数坐标系统曲线图，校正的曲线在50 ng/L～1 350 ng/L的范围内应成为线性，相对应的每一个样品的浓度，可以从曲线上读出。乘出稀释倍数即可得到样品中氯霉素的实际浓度（ng/kg）。

附  录  B

（规范性附录）

己烯雌酚（DES）残留的酶联免疫测定法

B.1  适用范围

本方法适用于测定水产品肌肉等可食组织中己烯雌酚的残留量。

B.2  原理

测定的基础是利用抗体抗原反应。微孔板包被有针对兔IgG（DES抗体）的羊抗体，加入DES抗、标准和样品溶液。DES与DES抗体连接，同时DES抗体与羊抗体连接。洗涤步骤后，加入DES酶标记物，DES酶标记物与孔中未结合的DES抗体结合，然后在洗涤步骤中除去未结合的DES酶标记物。将酶基质和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并孵育；结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝变为黄，在450 nm处没量，吸光度与样品的己烯雌酚浓度成反比。

B.3  检测限

己烯雌酚检测的下限为1mg/kg。

B.4  仪器

B.4.1  微孔酶标仪（450 nm）。

B.4.2  离心机。

B.4.3  37℃恒温箱。

B.4.4  移液器。

B.4.5  50mL，100mL，450mL微量加液器。

B.4.6  RIDA C18柱等。

B.5  试剂和标准溶液

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

B.5.1  叔丁基甲基醚。

B.5.2  石油醚。

B.5.3  二氯甲烷。

B.5.4  6 mol/L磷酸。

B.5.5  乙酸钠缓冲液等。

B.5.6  提供的DES标准液为直接使用液，浓度为0、12.5×10^–9mol/L、25×10^–9mol/L、50×10^–9mol/L、100×10^–9mol/L、200×10^–9mol/L。

B.6  样品处理

B.6.1  取5.0 g肌肉（除去脂肪组织），用10 mL pH为7.2的67 m mol/L磷酸缓冲液研磨后，用8 mL叔丁基甲基醚提取研磨物，强烈振荡20 min；离心10 min（4 000 r/min）；移去上清液，用8 mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物。

B.6.2  将两次提取的醚相合并，并且蒸发；用1 mL甲醇（70%）溶解干燥的残留物；用3 mL石油醚洗涤甲醇溶液（研磨15 s，短时间离心，吸除石油醚）。

B.6.3  蒸发甲醇溶液，用1 mL二氯甲烷溶解后，再用3 mL 1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液提取；然后300 mL 6 mol/L磷酸中和提取液，用RIDA C18柱进行纯化。

B.7  测定程序（室温20℃～24℃条件下操作）

B.7.1  将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。

B.7.2  加入20mL的标准和处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行实验。

B.7.3  加入50mL稀释后的DES抗体到每一个微孔中，充分混合并在2℃～8℃孵育过夜（注意：在第二早上继续进行实验之前，微孔板应在室温下放置30 min以上，稀释用缓冲液也应回到室温，因此最好将缓冲液放在室温下过夜）。

B.7.4  倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，用250mL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次。

B.7.5  加入5mL稀释的酶标记物到微孔底部，室温孵育1 h。

B.7.6  倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每次拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，用250mL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作一次。

B.7.7  加入50mL基质和50mL发色试剂到微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15 min。

B.7.8  加入100mL反应停止液到微孔中，混合好在450 nm处测量吸光度值（可选择＞600nm的参比滤光片），以空气为空白，必须在加入停止液后60 min内读取吸光度值。

B.8  结果

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，得到以百分比给出的吸光度值，以式（B.1）表示：

                                                  ············································ （B.1）

式中：

E——吸光度值，%；

A——标准或样品的吸光度值；

A₀——0标准的吸光度值。

以计算的标准值绘成一个对应DES浓度（ng/L）的半对数坐标系统曲线图，校正的曲线在25 ng/L～200 ng/L的范围内应成为线性，相对应的每一个样品的浓度，可以从曲线上读出。乘以稀释倍数即可得到样品中DES的实际浓度（ng/kg）。